SSH ISO 20395:2019

Bioteknologjia - Kërkesat për vlerësimin e performancës së metodave të kuantifikimit për sekuencat target të acideve nukleike — qPCR dhe dPCR

Biotechnology — Requirements for evaluating the performance of quantification methods for nucleic acid target sequences — qPCR and dPCR

Scope

Ky dokument përcakton kërkesa të përgjithshme për vlerësimin e performancës dhe sigurimin e cilësisë së metodave të përdorura për kuantifikimin e sekuencave specifike të acideve nukleike (targeteve).

Ky dokument zbatohet për kuantifikimin e sekuencave target të ADN-së (acidit deoksiribonukleik) dhe ARN-së (acidit ribonukleik), duke përdorur teknologjitë e amplifikimit me PCR digjitale (dPCR) ose me PCR sasiore në kohë reale (qPCR). Ai zbatohet për sekuencat target të pranishme në molekulat e acideve nukleike, duke përfshirë ADN-në dyvargore (dsDNA), si ADN-ja gjenomike (gDNA) dhe ADN-ja plazmidike, ADN-në njëvargore (ssDNA), ADN-në komplementare (cDNA), si dhe ARN-në njëvargore (ssRNA), duke përfshirë ARN-në ribozomale (rRNA), ARN-në lajmëtare (mRNA) dhe ARN-në jokoduese të gjatë dhe të shkurtër [mikroARN-të (miRNA) dhe ARN-të e shkurtra interferuese (siRNA)], si dhe ARN-në dyvargore (dsRNA).

Ky dokument zbatohet për acidet nukleike të prejardhura nga burime biologjike, të tilla si viruset, qelizat prokariote dhe eukariote, lëngjet biologjike pa qeliza (p.sh. plazma ose mjedisi i kulturës qelizore) ose burimet in vitro [p.sh. oligonukleotidet, konstruktet gjenike sintetike dhe ARN-ja e transkriptuar in vitro (IVT)].

Ky dokument nuk zbatohet për kuantifikimin e oligonukleotideve të ADN-së shumë të shkurtra (<50 baza).

Ky dokument mbulon:

— projektimin analitik, duke përfshirë strategjitë e kuantifikimit (kuantifikimin e numrit të kopjeve të acideve nukleike duke përdorur një kurbë kalibrimi, si në qPCR, ose nëpërmjet numërimit molekular, si në dPCR, kuantifikimin në raport me një mostër të pavarur dhe matjet e raporteve) dhe përdorimin e kontrolleve;

— kuantifikimin e përqendrimit masik të acideve nukleike totale dhe kontrollin e cilësisë së një mostre të acidit nukleik, duke përfshirë vlerësimin e cilësisë së acidit nukleik (pastërtisë dhe integritetit);

— projektimin e analizës PCR, optimizimin, si dhe testimin e specifikës in silico dhe in vitro;

— kontrollin dhe analizën e cilësisë së të dhënave, duke përfshirë kriteret e pranimit, përcaktimin e pragut dhe normalizimin;

— validimin e metodës (precizionin, linearitetin, kufirin e kuantifikimit, kufirin e zbulimit, vërtetësinë dhe qëndrueshmërinë), me kërkesa specifike për qPCR dhe dPCR;

— qasjet për vendosjen e gjurmueshmërisë metrologjike dhe vlerësimin e pasigurisë së matjes.

Ky dokument nuk përcakton kërkesa ose kritere pranimi për marrjen e mostrave të materialeve biologjike ose përpunimin e mostrave biologjike (d.m.th. mbledhjen, ruajtjen, transportin, magazinimin, trajtimin dhe ekstraktimin e acideve nukleike). Gjithashtu, ai nuk përcakton kërkesa dhe kritere pranimi për aplikime specifike (p.sh. aplikimet në ushqim ose në fushën klinike, ku mund të shfaqen çështje specifike që lidhen me matricën).